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您的位置:首頁>>分析化學>>試劑盒>>HK00206B ATP檢測試劑盒 ATP Assay Kit 200T 1170.00
Cat. Number
HK00206B
Chemical Name
HK00206B ATP檢測試劑盒 ATP Assay Kit 200T 1170.00
Qty 1
200T
References

ATP檢測試劑盒(ATP Assay Kit)可以用于檢測普通溶液、細胞或組織內的ATP(adenosine 5'-triphosphate)水平。
ATP,作為最重要的能量分子在細胞的各種生理、病理過程中起著重要作用。ATP水平的改變,會影響細胞的功能。通常細胞在凋亡、壞死或處于一些毒性狀態下,ATP水平會下降,而高葡萄糖刺激等對于一些細胞可以上調細胞內ATP水平。通常ATP水平的下降表明線粒體的功能受損或下降,在細胞凋亡時ATP水平的下降通常和線粒體的膜電位下降同時發生。


訂購信息:

產品編號產品名稱產品包裝產品價格
HK00206BATP檢測試劑盒200T1170.00元


技術原理:

本試劑盒根據螢火蟲螢光素酶(firefly luciferase,也稱熒光素酶)催化螢光素產生螢光時需要ATP提供能量研制而成。當螢火蟲螢光素酶和螢光素都過量時,在一定的濃度范圍內熒光的產生和ATP的濃度成正比,這樣就可以高靈敏地檢測溶液中的ATP濃度。本試劑盒在樣品體積為100微升時可以檢測濃度低達5nM的ATP。而常規的細胞或組織裂解液中ATP的濃度僅為0.1-1μM,一些常見細胞的細胞內ATP水平約為10nmol/mg蛋白。并且本試劑盒的檢測濃度范圍非常大,檢測上限可以高達10μM,并在10nM-10μM范圍內可以形成良好的標準曲線。

使用本試劑盒中的ATP檢測裂解液裂解獲得的細胞或組織樣品,不僅可以用于ATP檢測,還可用于檢測蛋白濃度、進行SDS-PAGE或一些常規的較易溶解蛋白的Western檢測。本試劑盒的使用方便快捷,通常10-20個樣品可以在30-60分鐘內測定完畢。


樣品制備:

樣品制備非常簡單。本試劑盒提供了可以用于細胞和組織裂解的ATP檢測裂解液,簡單裂解后即可用于ATP檢測。無需進行高氯酸或三氯乙酸(TCA)抽提,或樣品裂解后的煮沸等繁瑣操作。


產品特點:

產品名稱ATP檢測試劑盒
檢測靈敏度+++
特殊樣品兼容性+++++
信號值+++
信號穩定性++++
檢測下限(ATP)5nM
檢測上限(ATP)10μM
線性范圍(ATP)10nM-10μM


保存條件:
-20℃保存,半年有效。-70℃保存,一年有效。ATP檢測試劑需避光保存。


使用說明:
1. 樣品測定的準備:(注意:樣品裂解需在4℃或冰上操作)

對于貼壁細胞:

吸除培養液,按照6孔板每孔加入200微升裂解液的比例(即相當于細胞培養液量2毫升的1/10)加入裂解液,裂解細胞。裂解細胞時為了裂解充分,可以使用移液器進行反復吹打或晃動培養板使裂解液充分接觸并裂解細胞。通常細胞在接觸裂解液后會立即裂解。裂解后4℃ 12000g離心5分鐘,取上清,用于后續的測定。

對于懸浮細胞:

用離心管離心沉淀細胞,棄上清,輕輕彈散細胞,按照6孔板每孔的細胞量加入200微升裂解液的比例加入裂解液,裂解細胞。裂解細胞時為了裂解充分可以彈擊離心管管底或適當Vortex使裂解液充分接觸并裂解細胞。通常細胞在接觸裂解液后會立即裂解。裂解后4℃ 12000g離心5分鐘,取上清,用于后續的測定。

對于組織樣品:

按照每20毫克組織加入約100-200微升裂解液的比例加入裂解液,然后用玻璃勻漿器或其它勻漿設備進行勻漿。充分勻漿可以確保組織被完全裂解。裂解后4℃ 12000g離心5分鐘,取上清,用于后續的測定。

2. 標準曲線測定的準備:

冰浴上溶解待用試劑,把ATP標準溶液用ATP檢測裂解液稀釋成適當的濃度梯度。具體的濃度需根據樣品中ATP的濃度而定。初次檢測可以檢測0.1、1和10微摩爾/升這幾個濃度,在后續的實驗中,可以根據樣品中ATP的濃度對標準品的濃度進行適當調節。

3. ATP檢測工作液的配制:

按照每個樣品或標準品需100微升ATP檢測工作液的比例配制適當量的ATP檢測工作液。把待用試劑在冰浴上溶解。取適量的ATP檢測試劑,按照1:100的比例用ATP檢測試劑稀釋液稀釋ATP檢測試劑。例如50微升ATP檢測試劑可以加入5微升ATP檢測試劑稀釋液配制成5毫升ATP檢測工作液。稀釋后的ATP檢測試劑即為用于后續實驗的ATP檢測工作液。ATP檢測工作液可在冰浴上暫時保存。

4. ATP濃度的測定:

a. 加100微升ATP檢測工作液到檢測孔或檢測管內。室溫放置3-5分鐘,以使本底性的ATP全部被消耗掉,從而降低本底??梢砸淮涡园?0-20個檢測孔或檢測管分別加上100微升ATP檢測工作液,從而節省時間。

b. 在檢測孔或檢測管內加上20微升樣品或標準品,迅速用槍(微量移液器)混勻,至少間隔2秒后,用luminometer或液閃儀測定RLU值或CPM。(注:樣品的體積可以自行在10-100微升范圍內調節。如果樣品中的ATP濃度比較低則可以加入100微升樣品,如果樣品中ATP濃度比較高則可以加入較小體積的樣品,同時標準品也需要使用相同的體積。如果樣品中ATP的濃度特別高,可以用ATP檢測裂解液稀釋樣品后再測定。本試劑盒在加入100微升標準品時,大致在10nmol/L-10μmol/L的濃度范圍內有很好的線性關系。)

c. 根據標準曲線計算出樣品中ATP的濃度。

d. 為了消除樣品制備時由于蛋白量的差異而造成的誤差,可以用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定樣品中的蛋白濃度。然后把ATP的濃度換算成nmol/mg蛋白的形式。


常見問題:
1. Luminometer和熒光分光光度計有何不同?
熒光分光光度計檢測的樣品本身不能發光,樣品需要由特定波長的激發光激發,然后才能產生熒光并被熒光分光光度計檢測。Luminometer,即化學發光檢測儀,檢測的樣品本身可以發光,不需要激發光進行激發。也就是說Luminometer是檢測化學發光(螢光)的儀器。有些型號的熒光分光光度計也具有luminometer的功能,即也可以檢測化學發光。您所使用的熒光分光光度計能否用于化學發光的測定請仔細閱讀該儀器的說明書。

2. 可以進行螢光素酶報告基因檢測的儀器是否就可以用于本試劑盒的ATP檢測?

是。螢光素酶報告基因的檢測原理和本ATP檢測試劑盒的原理相同,可以用相同的儀器測定,并且可以選擇相同的測定參數,例如檢測前等待時間為2秒,檢測時間為10秒等。

3. 多功能酶標儀是否可以用于本試劑盒的ATP檢測?

不一定。如果該多功能酶標儀具有檢測化學發光的功能,即具有luminometer的功能,就可以用于本試劑盒的檢測,否則就不能了。


注意事項:
1. ATP檢測試劑中含有螢光素酶,反復凍融會導致其逐漸失活。盡管經測試ATP檢測試劑反復凍融5次對于其檢測效果無明顯影響,為取得較好的使用效果,建議用戶使用時的凍融次數不宜超過3次。ATP檢測試劑稀釋成ATP檢測工作液后,最好一次用完,不宜凍存后再使用。

2. ATP,特別是裂解后樣品中的ATP在室溫不太穩定,需在4℃或冰上操作。ATP在冰上可以穩定長達6小時。

3. 本試劑盒需使用luminometer,即化學發光儀(檢測螢光素酶報告基因時所用的儀器)。如果沒有luminometer,也可以使用液閃儀。液閃儀的測定效果取決于液閃儀的檢測靈敏度和檢測精度。

4. 使用可檢測化學發光的多功能酶標儀時,推薦使用孔和孔之間不透光的96孔白板或黑板。如使用普通的透明96孔板,須特別注意在檢測孔之間設置間隔孔,以減少鄰近孔之間的相互干擾。對于透明96孔板,一個發光孔可以使上下或左右鄰近孔的RLU值升高該孔的10-20%左右,使上下或左右間隔一個孔的鄰近孔的RLU值升高該孔的1%-4%左右;對于相同的樣品,底部不透光的96孔白板的化學發光讀數可以達到透明96孔板的5-10倍左右,達到底部透光96孔白板讀數的3倍左右(實測數據會因96孔板、檢測儀器和樣品等的不同而存在差異)。

5. 本試劑盒提供的ATP檢測裂解液可以有效裂解并釋放常見的培養細胞和組織中的ATP。對于一些特殊的組織或樣品,如果發現檢測出來的ATP水平顯著低于預期水平,可以在裂解樣品后并且在離心前,取部分樣品煮沸2分鐘以充分釋放ATP。煮沸后樣品中的蛋白會變性,從而會在后續的離心步驟中被沉淀,因此煮沸的樣品不能用于蛋白濃度測定、SDS-PAGE和Western檢測??梢允褂檬S嗟牟糠謽悠愤M行蛋白濃度測定、SDS-PAGE和Western檢測。

6. 本產品僅限于專業人員的科學研究用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品,不得存放于普通住宅內。

7. 為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。


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